Plasticidad de la dinámica neuronal en la habénula lateral como señal.

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

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La capacidad del cerebro para asociar amenazas con estímulos externos es vital para ejecutar conductas esenciales, incluida la evitación. La interrupción de este proceso contribuye, en cambio, a la aparición de rasgos patológicos que son comunes en la adicción y la depresión. Sin embargo, los mecanismos y la dinámica neuronal en la resolución unicelular que subyacen a la codificación del aprendizaje asociativo siguen siendo difíciles de alcanzar. Aquí, empleando una tarea de discriminación pavloviana en ratones, investigamos cómo las poblaciones neuronales en la habénula lateral (LHb), un núcleo subcortical cuya excitación subyace al afecto negativo, codifican la asociación entre estímulos condicionados y un castigo (estímulo incondicionado). Los registros de una sola unidad de población grande en la LHb revelan respuestas tanto excitadoras como inhibidoras a estímulos aversivos. Además, la inhibición óptica local previene la formación de discriminación de señales durante el aprendizaje asociativo, lo que demuestra un papel fundamental de la actividad de la LHb en este proceso. En consecuencia, las imágenes longitudinales in vivo de dos fotones que rastrean la dinámica neuronal del calcio LHb durante el acondicionamiento revelan un cambio hacia arriba o hacia abajo en las respuestas evocadas por CS de las neuronas individuales. Si bien las grabaciones en cortes agudos indican un fortalecimiento de la excitación sináptica después del condicionamiento, los algoritmos de la máquina de vectores de soporte sugieren que la dinámica postsináptica de las señales predictivas de castigo representa una discriminación de señales de comportamiento. Para examinar la señalización presináptica en la LHb que participa en el aprendizaje, monitoreamos la dinámica de los neurotransmisores con indicadores codificados genéticamente en ratones que se comportaban. Si bien la liberación de glutamato, GABA y serotonina en la LHb permanece estable durante el aprendizaje asociativo, observamos que se desarrolla una mayor señalización de acetilcolina durante el condicionamiento. En resumen, los mecanismos presinápticos y postsinápticos convergentes en la LHb subyacen a la transformación de señales neutrales en señales valoradas que apoyan la discriminación de señales durante el aprendizaje.

El condicionamiento pavloviano representa una función cerebral rastreable temporalmente en la que las señales sensoriales se asocian con estímulos incentivadores que permiten a los individuos anticipar amenazas y recompensas futuras. Este proceso es la base de resultados conductuales complejos que incluyen respuestas defensivas como la congelación o la evitación [1,2,3,4]. Durante el condicionamiento pavloviano, una señal sensorial, el estímulo condicionado (CS+), se asocia con un estímulo incondicionado (EE.UU.), por ejemplo, una bocanada de aire dirigida al ojo [4]. Al volver a exponerse únicamente al CS+, se provoca un parpadeo en la predicción de la siguiente bocanada de aire, lo que indica aprendizaje asociativo y el establecimiento de un comportamiento anticipatorio [1, 4, 5].

Trabajos anteriores encontraron neuronas de habénula lateral (LHb) con transmisión sináptica de glutamato potenciada después del aprendizaje junto con la excitación fásica de la LHb mediada por CS [6, 7]. En particular, esta excitación neuronal de LHb mediada por señales predictivas de castigo se conserva en todas las especies, ya que está presente en humanos, primates no humanos, roedores y peces [5, 8,9,10]. La LHb recibe información negativa de una red subcortical que incluye los núcleos hipotalámico, límbico y de los ganglios basales [11]. La actividad neuronal dentro de la LHb representa castigos y estados afectivos negativos en escalas de tiempo inferiores a un segundo y más lentas [12]. Mientras que las neuronas LHb aumentan gradualmente su actividad en respuesta a los castigos, durante condiciones de estrés elevado surgen adaptaciones sinápticas persistentes y una actividad neuronal mejorada [5, 13,14,15,16,17]. En conjunto, estas observaciones apoyan un vínculo causal entre la excitación de LHb y la codificación de valencia y afecto negativos [12]. Sin embargo, avances recientes señalan un grado de diversidad en la LHb que se basa tanto en características moleculares como funcionales [18,19,20,21]. Esto sugiere que parece poco probable que la excitación en todas las células LHb sea el único mecanismo para apoyar el aprendizaje asociativo de señal-castigo. Las poblaciones neuronales independientes y diferencialmente adaptativas permiten el aprendizaje y el almacenamiento de la memoria [22], aunque se desconoce si esto se aplica a la habénula y a través de qué mecanismos.

Aquí, combinamos un análisis controlado temporal y espacialmente de la dinámica neuronal y de neurotransmisores junto con una tarea de condicionamiento pavloviano aversivo en roedores despiertos para estudiar la contribución de la LHb al aprendizaje. Observamos que los castigos y las señales predictivas de castigos reclutan adaptaciones presinápticas y postsinápticas que permiten que conjuntos de células discretas en la LHb codifiquen recuerdos asociativos relacionados con el castigo.

Para este estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57BL/6 J de 7 a 25 semanas de edad (laboratorio Janvier, Francia; Charles River, Sulzfeld, Alemania). Los ratones se alojaron de tres a cinco por jaula con agua y comida ad libitum en un ciclo de luz de 12:12 h (las luces se encienden a las 7 am) en jaulas con ventilación individual (ICV, Innovive, Francia). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por las autoridades locales y se realizaron de acuerdo con las directrices del respectivo comité de ética local: el Comité de la Oficina Veterinaria Cantonal para la Experimentación Animal del cantón de Vaud (Suiza; Licencia VD3171), de conformidad con las Directrices institucionales nacionales suizas sobre experimentación animal. ; el Regierungspräsidium (Tübingen, Baden-Württemberg, Alemania; licencia CIN07/19G y CIN03/20G) de conformidad con la Ley alemana de bienestar animal (TierSchG) y la Ordenanza sobre bienestar animal de animales de laboratorio (TierSchVersV).

rAAV-DJ/8/2-hSyn1-eGFP-WPRE (título: 9,4x10E12 vg/ml), rAAV-DJ/8/2-hSyn1-GCaMp6f-WPRE (título: 4,5x10E12 vg/ml), ssAAV-5/ 2-hSyn1-iGluSnFR(A184S)-WPRE (título: 5,3x10E12 vg/ml) se adquirieron en UZH Vector Facility (Zurich, Suiza). AAV9-hSyn-5HT3.5 (título: 1x10E13 vg/ml), AAV9-hSyn-ACh3.0 (título: 1x10E13 vg/ml) se adquirieron de BrainVTA (Wuhan, China). pGP-AAV5-syn-iGABASnFR2-WPRE (título: 2,67x10E13 vg/ml) fue proporcionado por el Proyecto GENIE en el HHMI Janelia Research Campus (https://doi.org/10.25378/janelia.19709311.v3). rAAV8-hSyn1-Jaws-GFP (título: 1,3 x 10E13 vg/ml) se adquirió de Addgene.

Los ratones fueron anestesiados con ketamina (150 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) (Hospital Universitario Cantonal, Lausana, Suiza). La cirugía se realizó utilizando el protector ocular Viscotear para prevenir daños oculares, una almohadilla térmica para mantener una temperatura corporal estable y anestesia local (inyección subcutánea) con una mezcla de lidocaína (6 mg/kg) y bupivacaína (2,5 mg/kg). . Inyectamos unilateral o bilateralmente (cuando sea necesario para el experimento, es decir, optogenética in vivo) en la LHb (−1,4 mm AP, 0,45 mm ML, 3,1 mm DV) 150–250 nl de virus usando una pipeta de vidrio en un marco estereotáctico (Kopf , Francia). Todas las inyecciones se realizaron a una velocidad de aproximadamente 100 a 150 nl/min. La pipeta de inyección se retiró del cerebro 10 minutos después de la infusión. Se permitió que los animales se recuperaran durante un mínimo de dos semanas antes de la implantación de lentes de fibra o GRIN.

Para los experimentos de fotometría de fibra, se colocó y fijó una sonda de fibra única (200 μm, Chi Square Bioimaging) (C y B Metabond, Parkell) 100 μm por encima del sitio de inyección en la LHb. Para la manipulación optogenética, se colocó una sola fibra (200 μm, Thorlabs) en las siguientes coordenadas (AP: −1,4 mm, L: ± 0,1 mm, V: −2,2 mm). La cirugía se realizó bajo anestesia con isoflurano (inducción: 4%, mantenimiento: 1,8-2%, Univentor). Para los experimentos con endoscopio, se anestesiaron ratones (como se describe anteriormente) y se les implantó una lente GRIN (6,1 mm de longitud, 0,5 mm de diámetro; Inscopix, n.º 100-000588). La lente se colocó entre 150 y 200 μm por encima del sitio de inyección utilizando las siguientes coordenadas de bregma (−1,40 mm AP, 0,45 mm ML, −2,85 a −2,9 mm DV; bajada a una velocidad de 1 μm/s). Se implantó una barra de acero inoxidable en el cráneo. Para ello, se raspó el cráneo y se cubrió con una capa de pegamento de cianoacrilato (Vetbond, 3 M). Se bajó la barra de cabeza para tocar el cráneo sobre lambda, luego se aseguró al cráneo con una capa de adhesivo dental (C y B Metabond, Parkell), seguido de cemento dental (Jetkit, Lang). Para el tratamiento del dolor, se añadió paracetamol (500 mg/250 ml; 200-300 mg/kg/día) al agua potable después de la cirugía. La expresión viral adecuada y la colocación de lentes de fibra/GRIN en áreas de interés del cerebro se confirmaron post hoc mediante histología para todos los experimentos.

Para la histología, los ratones se anestesiaron terminalmente con ketamina y xilazina o pentobarbital y se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M. Los cerebros se recogieron y se dejaron durante la noche en PFA al 4% a 4 °C hasta el corte. Se seccionaron cortes coronales consecutivos (60–100 micrones) utilizando un vibratomo (Leica VT1200S). Tomamos imágenes con un microscopio epifluorescente (Zeiss) para confirmar la focalización eficiente de la LHb, y descartamos los ratones cuando esto no se logró (fibra óptica, mala colocación de la lente GRIN o expresión viral no dirigida).

Las neuronas marcadas yuxtacelularmente (como en las Fig. 1B, C) se visualizaron de acuerdo con procedimientos publicados previamente [23]. Específicamente, los cerebros se cortaron en un vibratomo (VT1200S; Leica) para obtener secciones parasagital o coronal de 50 a 70 μm de espesor. Los cortes de cerebro se procesaron con conjugados de estreptavidina (estreptavidina-546 o -488, Invitrogen). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron mediante microscopía de epifluorescencia (Axio imager; Zeiss) y microscopía confocal (LSM 900; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Para calcular una fluorescencia arbitraria relativa (RAF) de la expresión de Jaws en LHb y regiones vecinas, la intensidad de la señal verde se normalizó frente a una región que no contenía fluorescencia verde (fondo) usando la fórmula: (señal - fondo/señal + fondo).

un protocolo experimental relacionado con los registros electrofisiológicos unitarios extracelulares en ratones anestesiados; Por cada neurona registrada, los ratones recibieron entre 20 y 120 descargas en el pie contralateral. b Trazo electrofisiológico, diagrama de trama, respuesta de disparo promedio e imagen de un ejemplo de neurona excitada por choque en el pie etiquetada en LHb (barra de escala superior = 500 µm, inferior = 100 µm). c Igual que b, pero para una neurona inhibida por choque del pie. d Mapa de calor de la respuesta promedio con puntuación z de una sola neurona a la presentación de FS (nneuronas = 196; nneuronas EXC = 134, nneuronas INH = 37, nneuronas NR = 25). e Gráficos t-SNE con índice de modulación FS codificado por colores superpuestos (arriba) y velocidad de disparo de referencia (abajo). Gráfico de dispersión con correlación lineal de la tasa de activación y el índice de modulación con todas las células (nneuronas = 196, ***p < 0,001).

Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones de cerebro se permeabilizaron a temperatura ambiente (RT) en Triton X-100 al 0,5% (Sigma), seguido de un bloqueo de RT durante 1 h en BSA al 2%, Triton X-100 al 0,5% y una incubación durante la noche con anticuerpos primarios (EAAC1, AB1520 Millipore, 1:100; GAD67, MAB#5406 Clon 1G10.2, 1:1000) a 4ºC. Tras el lavado, las secciones se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo de Alexa (Invitrogen). La microscopía confocal se realizó con un sistema de escaneo láser Stellaris 5 (Leica) y las imágenes se procesaron y analizaron mediante el software FIJI/ImageJ. Se establecieron umbrales y se utilizaron proyecciones confocales de pila en z de micrografías confocales para la señal GCaMP6f-GFP y para la inmunofluorescencia EAAC1 o GAD67 para delinear manualmente las células positivas. Posteriormente se multiplicaron las máscaras celulares producidas para GCaMP6f y EAAC1 o GAD67 para generar los recuentos de células doblemente positivas.

Para el condicionamiento pavloviano, se fijó la cabeza de los ratones en un cilindro acrílico de 3 cm de ancho. El entorno se adaptó a partir de preparaciones metodológicas de condicionamiento del parpadeo de la siguiente manera. Se equipó una cámara Basler (a2A1920-160umPRO o acA1300-60gc) con un macroobjetivo (ya sea Fujinon HF9HA-1S o computadora M3Z1228C-MP) y se utilizaron LED infrarrojos para iluminar la cara de los ratones. Para la evaluación del comportamiento durante la obtención de imágenes de calcio de dos fotones, la cámara estaba equipada con un filtro de paso corto NIR con un corte de 900 nm (FES0900, Thorlabs) para filtrar la luz de excitación. El airpuff se administró con presión desde un Picospritzer III (Parker) con una aguja de 23G dirigida al ojo derecho (a 1 cm de distancia). Se colocó un altavoz para emitir tonos acústicos cerca de los ratones y se controló mediante un disparador de MP3 WIG-13720 (Sparkfun). El aparato de comportamiento se controló mediante un código personalizado de Arduino. Los eventos de tareas de comportamiento se transfirieron a Excel con la interfaz PLX-DAQ. La videografía facial se grabó con una velocidad de fotogramas de 10 Hz.

Antes de que comenzara el comportamiento, se manipularon los ratones (1-2 días) y se les familiarizó con la fijación de la cabeza (1-2 días). El comportamiento comenzó con 2 sesiones de habituación en las que a los ratones se les presentaron 30 CS+ (sonido trino de 16 kHz, 75 dB, duración: 1 s), 30 CS- (tono puro de 10 kHz, 75 dB, duración: 1 s) y 5 US imprevistos. (airpuff, presión: 4-5 psi, duración: 0,5 s), entregado en orden aleatorio con un intervalo entre pruebas de entre 30 y 45 segundos. Durante las sesiones de acondicionamiento (2-3 días), los ratones recibieron un total de 30 ensayos de CS- y 30 ensayos de CS+ en los que se siguió la ecografía después de un retraso de 0,5 s desde el final de la CS. Para las grabaciones de dos fotones, los ratones fueron sometidos a sesiones adicionales de habituación y acondicionamiento (de 1 a 5) para maximizar la recopilación de datos. Para las grabaciones in vitro, el grupo emparejado (P) fue entrenado como se describe, mientras que el grupo no emparejado (U) recibió el mismo número de estímulos con las mismas características, pero CS+ y US nunca fueron contingentes (30 CS+, 30 CS- y 30 no previstos). ensayos estadounidenses). Para el silenciamiento optogenético mediado por Jaws, un láser (Matchbox Integrated Optics) entregó luz de 638 nm (3 mW) al LHb a través de un cable de fibra (M83L1, Thorlabs) conectado a una fibra óptica implantada en la cabeza del ratón (CMFLC12L05). , Thorlabs). La luz se entregó durante las pruebas CS+ durante 5 s a partir de la presentación de la señal.

La evaluación del comportamiento se registró durante un total de 15 s en cada prueba con una frecuencia de muestreo de 10 fps comenzando 5 s antes de la entrega de CS o US. Los datos se analizaron utilizando un script Python personalizado estableciendo umbrales en las imágenes para obtener solo los valores de píxeles del ojo. Estos valores se normalizaron al 100 por ciento prueba por prueba en referencia al valor promedio durante los 5 segundos antes de la presentación de la señal. A partir de estos datos, la amplitud de la respuesta condicionada (CR) se calculó promediando los valores entre el inicio de la entrega de la señal (tiempo: 0 s) y el inicio de la presentación del airpuff (tiempo: 1,5 s). La puntuación de discriminación se obtuvo restando el valor medio del CR de los ensayos CS+ al de los ensayos CS-.

Se llevaron a cabo experimentos de microscopía de dos fotones para visualizar la dinámica del calcio neuronal de LHb in vivo. Las grabaciones y el acondicionamiento pavloviano comenzaron cuando el campo de visión (FOV) fue claro y estable durante al menos 3 semanas, generalmente entre 1 y 3 meses después de la implantación de la lente GRIN. La adquisición se realizó con un microscopio Ultima Investigator de dos fotones (Bruker) combinado con un láser Chamaleon-Ultra Tunable (Coherent) y equipado con un objetivo de aire Olympus 20 × (LCPLN20XIR). El microscopio de dos fotones está equipado con un núcleo de escaneo híbrido con galvanómetros y escáneres resonantes rápidos (adquisición de velocidad de fotogramas de hasta 30 Hz), fotodetectores PMT multiálcali y GaAsP-PMT con voltaje ajustable, ganancia y características de compensación, un Cubo de filtro NDD verde/rojo único.

Las imágenes se adquirieron a 30 Hz con una resolución de 512 × 512 píxeles y realizamos un promedio en línea de 6 veces para obtener una velocidad de cuadros real de 5 Hz. La potencia media del haz medida en la parte frontal del objetivo estaba entre 80 y 125 mW. En cada prueba, las grabaciones comenzaron 5 segundos antes de la entrega de la señal y se recopiló un vídeo de 15 segundos de duración. Las imágenes se recogieron utilizando una computadora equipada con Prairie View (Bruker). Antes de que comenzara el experimento, se eligieron de 1 a 3 FOV por ratón para maximizar el número de neuronas registradas en cada sesión ajustando el plano de imagen (eje z), y cada FOV se espació al menos 60 μm entre sí para evitar la visualización del mismas celdas en múltiples FOV. Para las sesiones de imágenes con múltiples campos de visión, la sesión de acondicionamiento se dividió, permitiendo un número igual de pruebas por FOV. Se excluyeron del análisis las sesiones en las que los ratones no mostraron ningún fenotipo de aprendizaje conductual.

Después de la recopilación de datos, los videos se corrigieron por movimiento con un modelo plano oculto de Markov (SIMA v1.3.2) y las regiones de interés (ROI) se dibujaron manualmente alrededor de cada celda usando la proyección de desviación estándar del video con corrección de movimiento usando ImageJ.19 . Las neuronas que no fueron rastreadas durante al menos una sesión de habituación y una sesión de acondicionamiento no se mantuvieron en el análisis. A continuación, se extrajeron los datos de series temporales de fluorescencia con el complemento ImageJ BAR y se analizaron utilizando canales de análisis de datos personalizados de Python. El % ΔF/F0 se calculó prueba por prueba como: ((F − F0)/F0)*100, donde F0 es el promedio de los tres segundos anteriores al inicio de la presentación de CS. Para clasificar las neuronas en función de sus respuestas a CS y US (inhibidas, sin respuesta o excitadas), comparamos el área bajo la curva (AUC) durante 1,5 s de referencia versus el AUC durante el período de anticipación de 1,5 s (CS y retraso) o Presentación de EE. UU. (Prueba de suma de rangos de Wilcoxon, utilizando un umbral de significancia de p ≤ 0,05). Luego se utilizó la prueba de χ2 para comparar la distribución de las respuestas en los ensayos CS+ y CS-, y entre sesiones.

Realizamos análisis de decodificación para determinar si la actividad neuronal podría usarse para predecir el parpadeo general del ratón durante la presentación de señales en cualquier ensayo determinado. Para hacerlo, utilizamos un decodificador binario para cada neurona donde su actividad (calculada como AUC) durante la presentación de la señal (es decir, de 0 a 1,5 s desde el inicio de la señal) se usó para predecir si el parpadeo (como CR) era menor que el Percentil 60 o superior al percentil 40 de esa sesión en particular.

Para completar el análisis de decodificación, utilizamos el módulo de Python Scikitlearn con GridSearchCV y un estimador de clasificación de vectores de soporte (SVC) [24]. Esto incluía un núcleo de función de base radial. La cuantificación del rendimiento se realizó mediante una validación de 100 veces para cada neurona; la puntuación de precisión promedio de estos parámetros se utilizó como métrica de precisión. Para determinar si las puntuaciones de precisión de la neurona en todas las repeticiones fueron significativamente diferentes de las esperadas por casualidad, realizamos una única combinación aleatoria por neurona aleatorizando la identidad de la señal en cada prueba y probamos utilizando una prueba t no apareada.

Los registros de fotometría de fibra se realizaron utilizando el sistema ChiSquare X2-200 (ChiSquare Biomaging, Brookline, MA). Brevemente, la luz azul de un láser pulsado de picosegundos de 473 nm (a 50 MHz; ancho de pulso ~80 ps FWHM) se entregó a través de una fibra monomodo. La emisión de fluorescencia se recogió mediante una fibra multimodo con una frecuencia de muestreo de 100 Hz. Las fibras monomodo y multimodo se dispusieron una al lado de la otra en una férula que está conectada a un implante de fibra multimodo desmontable. Los fotones emitidos se filtraron mediante filtro de paso de banda (FF01-550/88, Semrock) en un detector de un solo fotón. Los fotones se registraron mediante el módulo de conteo de fotones individuales correlacionado en el tiempo (TCSPC) (SPC-130EM, Becker and Hickl, GmbH, Berlín, Alemania) en el sistema ChiSquare X2-200. Los registros fotométricos se analizaron utilizando un código Python personalizado donde la señal se suavizó (promedio móvil: 10) y el % ΔF/F0 se calculó prueba por prueba como: ((F − F0)/F0)*100, donde F0 es el promedio de los tres segundos anteriores al inicio del CS (o presentación estadounidense para pruebas estadounidenses imprevistas). Para determinar si pudimos recopilar una señal válida, para cada ratón, analizamos la respuesta promedio durante la sesión de habituación a la presentación de CS y EE. UU. Mantuvimos solo los ratones donde pudimos detectar respuestas fotométricas positivas o negativas cuando el número medio de fotones/bin en al menos 3 épocas (50 ms por época) era mayor que el promedio inicial más dos veces la desviación estándar (SD) o menos. que el valor inicial menos dos veces la DE.

Los registros yuxtacelulares de neuronas LHb individuales (conjunto de datos en la Fig. 1) se realizaron como se describió anteriormente [14, 25, 26]. Se obtuvo un subconjunto de registros (nneuronas = 149) en animales anestesiados con una mezcla de ketamina/xilazina según procedimientos publicados previamente [26]. Brevemente, las craneotomías se realizaron en coordenadas estereotáxicas (1,5 mm posterior, 0,5 mm lateral al bregma) por encima de la LHb. Los electrodos de vidrio (impedancia: 7-9 MOhm) se llenaron con una solución que contenía trazador (1,5–2% de neurobiotina, SP-1120, Vector Laboratories). Se adquirieron señales de voltaje yuxtacelulares (ELC-03XS, NPI Electronic, Tamm, Alemania) y se digitalizaron a 25 kHz (POWER1401-3 y Spike2 v. 8.02e, CED, Cambridge, Reino Unido). Los picos espontáneos se controlaron durante al menos 5 minutos, seguidos de una estimulación de choque en el pie (−1 mA, 0,5 s, cada 5 s, número de pruebas = 20–197 pruebas) en la extremidad trasera contralateral (Aislador de estímulo A365R, WPI). El marcaje yuxtacelular se realizó mediante procedimientos estándar. Se excluyeron del análisis los registros en los que se confirmó histológicamente que estaban fuera de LHb y los registros que contenían más de una unidad o indicaciones de daño celular. Los picos de señales yuxtacelulares se aislaron mediante detección de picos basada en umbrales e inspección visual asistida por PCA, esencialmente como se describió anteriormente [27]. Después del registro, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital, perfundidos transcardialmente y sus cerebros procesados ​​para análisis histológico como se describió anteriormente [23] (ver también 'histología e inmunohistoquímica' más arriba).

Parte del conjunto de datos yuxtacelulares de la Fig. 1 se obtuvo previamente (nneuronas = 121) de parte de los datos incluidos en Congiu et al. 2019 y Lecca et al. 2017. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo como se describió anteriormente [14, 25]. Brevemente, los ratones se anestesiaron con isoflurano (inducción: 4%; mantenimiento: 1–1,5%) y se colocaron en el aparato estereotáxico (Kopf, Alemania). Su temperatura corporal se mantuvo a 36 ± 1 °C utilizando una almohadilla térmica controlada por retroalimentación (controlador de temperatura CMA 450, Phymep). Se retrajo el cuero cabelludo y se perforó un orificio por encima de la LHb (AP: −1,3 a −1,6 mm, L: 0,35–0,5 mm, V: −2,3 a −3,2 mm) para colocar un electrodo de registro. La actividad de una sola unidad se registró extracelularmente utilizando micropipetas de vidrio llenas de azul cielo de Chicago al 2% disuelto en acetato de sodio 0,5 M (impedancia 5–15 MΩ). La señal se filtró (paso de banda 500–5000 Hz), se preamplificó (DAM80, WPI, Alemania), se amplificó (Neurolog System, Digitimer, Reino Unido) y se mostró en un osciloscopio de almacenamiento digital (OX 530, Metrix, EE. UU.) . Se tomaron muestras de los experimentos dentro y fuera de línea mediante una computadora conectada a la interfaz de laboratorio CED Power 1401 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) que ejecutaba el software Spike2 (Cambridge Electronic Design).

Se aislaron unidades individuales y se registró la actividad espontánea durante un mínimo de 3 minutos antes de evaluar su respuesta a la descarga del pie (duración: 0,5 s, intensidad: 1 mA, ITI: 5 s). Al final de cada experimento, los ratones fueron sacrificados (sobredosis de isoflurano antes de matarlos) y la colocación de los electrodos se determinó con un depósito iontoforético de tinte azul cielo de pontamina (1 mA, corriente continua durante 5 minutos). Luego, los cerebros se extrajeron rápidamente y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4%. La posición de los electrodos se identificó con un microscopio en secciones coronales (60 μm). Sólo se consideraron para el análisis las grabaciones en el área correcta.

Los ratones se anestesiaron (ketamina/xilazina; 150 mg/100 mg kg-1), se sacrificaron y sus cerebros se transfirieron a una solución carbogenada helada (95 % O2/5 % CO2), que contenía (en mM) cloruro de colina 110; glucosa 25; NaHCO3 25; MgCl27; ácido ascórbico 11,6; piruvato de sodio 3,1; KCl 2,5; NaH2PO4 1,25; CaCl20,5. Se prepararon cortes coronales de cerebro (250 μm de espesor) y se transfirieron durante 5 minutos a una solución calentada (34 °C) de composición idéntica, antes de transferirlos a temperatura ambiente en un líquido cefalorraquídeo artificial carbogenado (ACSF) que contenía (en mM) NaCl 124; NaHCO3 26,2; glucosa 11; KCl 2,5; CaCl2 2,5; MgCl2 1,3; NaH2PO4 1. Durante las grabaciones, las rebanadas se superfundieron continuamente con ACSF a un caudal de 2,5 ml min-1 a 32 °C. Las neuronas se sujetaron con parches utilizando pipetas de vidrio de borosilicato (2,7–4 MΩ; Phymep, Francia) bajo un microscopio Olympus-BX51 (Olympus, Francia). La señal fue amplificada, filtrada a 5 kHz y digitalizada a 10 kHz (Multiclamp 200B; Molecular Devices, EE. UU.). Los datos se adquirieron utilizando Igor Pro con herramientas NIDAQ (Wavemetrics, EE. UU.). La resistencia al acceso se monitoreó continuamente con un paso de -4 mV entregado a 0,1 Hz. La estimulación extracelular del estimulador AMPI ISO-Flex se administró a través de electrodos de vidrio colocados en la LHb. Todas las grabaciones se realizaron en configuración de abrazadera de voltaje. Para AMPA/GABA, las corrientes excitadoras evocadas se registraron a -60 mV y las corrientes inhibidoras evocadas se registraron a +5 mV. Las relaciones AMPA/NMDA se obtuvieron registrando las EPSC del compuesto AMPA + NMDA a +40 mV y restando el componente insensible a APV (APV, 100 μM). La relación de pulsos emparejados se obtuvo registrando las neuronas a -60 mV y entregando dos pulsos a intervalos entre pulsos de 50 ms. Las corrientes excitadoras espontáneas se aislaron farmacológicamente mediante la aplicación en baño de picrotoxina (PTX, antagonista de GABAAR; 100 μM). La solución interna contenía (en mM) CsMeSO3 120, CsCl 10, HEPES 10, EGTA 10, fosfato de creatina 5; Na2ATP4; Na3GTP 0.4, QX-314 5. Todos los medicamentos se compraron en HelloBio.

Se probaron ratones machos C57BL/6 J de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad en un campo de comportamiento hecho a medida con dos compartimentos con diferentes señales visuales y textura de pared durante 15 minutos. El tiempo transcurrido en cada compartimento se registró mediante una cámara digital conectada con el software Ethovision (Noldus). El lado emparejado para el tono auditivo CS+ se asignó aleatoriamente y se equilibró entre los sujetos y grupos experimentales. Los ratones se habituaron durante una sesión al tono para evitar efectos inducidos por la novedad. Al comienzo de la sesión de prueba, el ratón se colocó en el lado no emparejado de la cámara. Cada vez que el mouse cruzaba al lado emparejado, se reproducía un tono CS+ (duración 1 s; ITI 5 s) a través de señales temporizadas de hardware controladas por una caja de E/S (Noldus). El sonido se interrumpía en cualquier momento en el que el ratón abandonaba el lado emparejado.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism (v.9, GraphPad) o la biblioteca scikit-learn de Python. Las pruebas estadísticas utilizadas en este estudio incluyen la prueba t pareada y no pareada, las pruebas de pares emparejados de Wilcoxon, la prueba de chi cuadrado y el análisis de varianza unidireccional y bidireccional (ANOVA). Cuando se utilizaron pruebas paramétricas, la normalidad de los datos se confirmó mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Walk. Los valores de P se corrigieron para comparaciones múltiples cuando fue necesario. En los diagramas de caja, las líneas centrales indican la mediana y los límites de la caja indican los cuantiles superior e inferior (95%); Los diagramas de caja incluyen observaciones individuales. El umbral de significancia se mantuvo en α = 0,05 y las pruebas fueron bilaterales. Los tamaños de las muestras no se predeterminaron mediante métodos estadísticos, sino que se basaron en entornos experimentales dentro del laboratorio. Los experimentos fueron aleatorios siempre que fue posible. Los experimentadores no desconocían el grupo experimental, aparte de los registros electrofisiológicos in vitro. Los experimentos se replicaron al menos dos veces dentro del laboratorio. Las incorporaciones de t-SNE se generaron utilizando 15 características electrofisiológicas: los primeros cuatro componentes principales de las distribuciones de intervalos entre picos (ISI; tamaño del contenedor: 10 ms; calculado para un rango de 1 s), los primeros cuatro componentes principales de los autocorrelogramas (ACG; tamaño del contenedor : 1 ms; calculado para un rango de 500 ms y un rango más estrecho de 100 ms), velocidad de disparo espontáneo, coeficiente de variación (CV; desviación estándar de ISI/ISI medio, como en Softky y Koch 1993) e índice de ráfaga (fracción de ISI menores de 25 ms). Para clasificar las neuronas como shock en el pie excitado, inhibido y no modulado, comparamos la tasa de activación inicial (FRbaseline; 1 s antes del inicio del estímulo) con la tasa de activación del estímulo (FRstimulus; 1 s después del inicio del estímulo). De las 220 neuronas con estimulación de descarga en el pie, solo se incluyeron en este análisis neuronas con> 20 ensayos de estimulación de descarga en el pie (nneuronas = 196), para tener un poder estadístico adecuado. Las neuronas se clasificaron como excitadas o inhibidas por FS comparando el estímulo FR y el valor inicial de FR (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, alfa = 0,5); las neuronas con estímulo FR > FRbaseline se asignaron al grupo excitado por FS y las neuronas con FRstimulus

Los castigos generan excitación de las neuronas LHb, medida mediante registros de la actividad neuronal en ratones anestesiados y análisis de señales de calcio (Ca2+) a través de fotometría de fibra [7, 10, 14]. Esto condujo a un marco general según el cual la LHb codifica la aversión a través de su excitación. Sin embargo, trabajos recientes indican que las propiedades de respuesta de las neuronas LHb individuales a estímulos aversivos podrían ser más heterogéneas [25, 28, 29]. Para explorar sistemáticamente esta posibilidad, realizamos registros yuxtacelulares de neuronas LHb individuales en ratones anestesiados, mientras aplicamos estímulos de choque en las patas (Fig. 1a). De acuerdo con observaciones anteriores [25, 30], encontramos que los estímulos de choque del pie condujeron a un rápido aumento en la actividad de picos en la mayoría de las neuronas LHb (Fig. 1b). En particular, estas respuestas excitadoras fueron heterogéneas en su cinética, probablemente debido a diversas conductancias iónicas u organización de entrada sináptica en las células LHb (Figuras complementarias S1a-f). Aparte de la población excitada por el shock del pie, los estímulos inhibieron significativamente un subconjunto distinto de células LHb (Fig. 1c, d). Para explorar si las respuestas de choque del pie se relacionan con los patrones de activación in vivo de las neuronas LHb, utilizamos la incrustación de vecinos estocásticos [31] y visualizamos las neuronas en un espacio bidimensional (Fig. 1e; ver Métodos). El mapeo de las respuestas de choque del pie en la incrustación de tSNE, que se creó basándose únicamente en características de picos espontáneos (ver Métodos), reveló una organización gradual de las respuestas de choque del pie que se correlacionaban con las tasas de disparo espontáneo (Fig. 1e). De hecho, la modulación del impacto del pie y las tasas de disparo espontáneo se correlacionaron negativamente (Fig. 1f; [25]). Por lo tanto, estos datos indican que en la LHb, los castigos generan respuestas rápidas y opuestas siguiendo una organización no aleatoria donde la excitación del choque del pie es más común en las neuronas de baja activación, mientras que la inhibición en las células de alta activación. En conjunto, esta diversidad de respuestas amplía el marco predominante actual en el que la LHb codifica la aversión únicamente a través de la excitación neuronal.

Para comprender si las firmas funcionalmente diversas de la actividad de la LHb en relación con los castigos son ciertas en ratones despiertos y que se comportan, modificamos una tarea de condicionamiento clásica diseñada para investigar la codificación de valores en las neuronas de dopamina con el objetivo de estudiar la dinámica neuronal con una resolución unicelular. 1, 4]. Se entrenó a ratones con la cabeza fija para asociar un estímulo auditivo condicionado (CS+), pero no otro (CS-), con una bocanada de aire dirigida al ojo (Fig. 2a, b). Después de dos sesiones de habituación a las señales auditivas y dos sesiones de acondicionamiento en las que solo el CS+ dependía de la presentación del airpuff, los ratones mostraron un parpadeo anticipado solo al CS+, lo que indica una asociación CS-US (Fig. 2c; Fig. Suplementaria S2a-d) . Para cuantificar el aprendizaje congruente, rastreamos y analizamos el área de los ojos durante la CS para calcular la puntuación de discriminación (CS – promedio - CS + promedio), una medida significativamente mayor después del acondicionamiento en comparación con la habituación (Fig. 2d; Fig. complementaria S2e, f). A continuación, nuestro objetivo fue investigar la necesidad de la LHb para la discriminación de señales durante el aprendizaje asociativo reduciendo ópticamente su actividad. Transdujimos neuronas LHb con una bomba de cloruro impulsada por luz (espectro de activación naranja-rojo) mediante la infusión de rAAV8-hSyn1-Jaws-EGFP (Fig. 2e). Cuatro semanas después, evaluamos la actividad neuronal de LHb basal mediante registros de una sola unidad en ratones anestesiados [14]. La luz a 638 nm produjo una reducción temporal en la tasa de activación basal de las neuronas LHb (Figuras complementarias S3a-d). Por tanto, Jaws reduce eficazmente la actividad neuronal de LHb. A continuación, implantamos crónicamente ratones que expresan Jaws con una sola fibra óptica por encima de la LHb (Fig. 2e; Fig. complementaria S3e, f). La luz brillante a 638 nm para inhibir la función de LHb durante la presentación de CS + y EE. UU. disminuyó la discriminación de señales durante el acondicionamiento (Fig. 2f; Fig. Suplementaria S3g). Reconocemos una mínima extensión de las mandíbulas en el núcleo paraventricular del tálamo (PVT), una estructura también relevante para la asociación señal-castigo [32]. Aunque no podemos descartar completamente la contribución de PVT en nuestra tarea, la evidencia experimental presentada, la profundidad de la penetración de la luz roja y la ubicación de las sondas de fibra apoyan a la LHb como actor en el establecimiento de la discriminación de señales conductuales que surgen durante el aprendizaje asociativo.

a Protocolo experimental de la configuración conductual para la tarea de condicionamiento pavloviano en ratones despiertos con la cabeza sujeta. b Izquierda, esquema que representa la estructura del condicionamiento; a la derecha, imágenes de ejemplo de las respuestas de comportamiento durante la tarea c. Curso temporal de los cambios promedio en el área de los ojos en las pruebas CS+ durante la habituación (H) y el acondicionamiento (C) (nratones = 10). d Diagrama de caja de la puntuación de discriminación durante la habituación y el condicionamiento (nratones = 10; prueba t pareada, t9 = 4,92, ***p < 0,001). e Arriba, esquema de inhibición optogenética y sección coronal representativa de la expresión de Jaws en la LHb y el recorrido de la fibra (barra de escala: 200 µm); abajo, esquema del protocolo experimental para la inhibición optogenética de LHb. f Gráficos de caja de la puntuación de discriminación para ratones GFP (nratones = 7; prueba t pareada, t6 = 3,20, *p = 0,019) y ratones Jaws (nratones = 10; prueba t pareada, t9 = 0,059, p = 0,954).

Para rastrear la actividad neuronal de la LHb en ratones que se comportan durante el condicionamiento pavloviano, inyectamos una construcción viral que codifica el indicador de Ca2+ GCaMP6f (rAAVdj-GCaMP6f) en la LHb [7]. A continuación, implantamos una lente microendoscópica que permite el acceso óptico crónico a la LHb a través de un microscopio de dos fotones equipado con un objetivo de aire de 20X (Fig. 3a-c). El análisis post hoc reflejó que la mayoría de la población neuronal LHb que expresaba GCaMP6f era glutamatérgica y no GABAérgica (es decir, EAAC1+ y GAD67–; Fig. 3a; Fig. Suplementaria S4a-c; [7]). Registramos neuronas LHb que expresan GCaMP6f en múltiples campos de visión (FOV) dentro de cada ratón (n = 12 ratones, 21 FOV, 339 neuronas; Fig. 3d). Calculamos las respuestas neuronales impulsadas por señales y descubrimos que, mientras que una población de neuronas LHb mostró un aumento sustancial en su fluorescencia, un conjunto neuronal diferente mostró una reducción en la fluorescencia después de la presentación de la señal predictiva de castigo durante el condicionamiento, en comparación con la habituación. período (Fig. 3d). En particular, las respuestas neuronales impulsadas por CS+ antes del condicionamiento probablemente se debieron a la prominencia del estímulo y no a un componente aversivo intrínseco de la señal auditiva. De hecho, los ratones no mostraron evitación en una prueba de paradigma de lugar en tiempo real (Figura complementaria S5a). En particular, las neuronas sensibles a CS+ también fueron sintonizadas en la misma dirección por la bocanada de aire (Figura complementaria S5b, c). El seguimiento y la cuantificación de las señales de fluorescencia durante la presentación de CS+ y CS– fueron indicativos de plasticidad después del acondicionamiento (Fig. 3e). De hecho, encontramos que a lo largo de la habituación al condicionamiento, 121/339 neuronas mostraron un aumento en la fluorescencia mediada por Ca2+ (probablemente correspondiente a una mayor excitación) sincronizada con el CS+, mientras que 47/339 mostraron una reducción significativa en la fluorescencia del CS+ a lo largo del tiempo. aprendizaje (probablemente correspondiente a una mayor inhibición; Fig. 3f, g; P ≤ 0,05, señales evocadas por CS versus línea de base, prueba de suma de rangos). Por lo tanto, distintas poblaciones de neuronas LHb desarrollaron una mejora de las respuestas excitadoras o inhibidoras existentes, así como nuevas respuestas excitadoras o inhibidoras a una señal predictiva de castigo a lo largo del aprendizaje.

a Esquema de la preparación experimental para la obtención de imágenes de calcio de dos fotones de LHb, ejemplo de sección histológica coronal de la lente GRIN colocada sobre LHb (barra de escala: 200 µm), expresión de GCaMP6f en neuronas de LHb (barra de escala: 100 µm) y tinción de EAAC1 marcador glutamatérgico (barra de escala: 30 µm). b Representación esquemática del entorno experimental para grabaciones de imágenes de calcio de dos fotones en ratones despiertos con la cabeza sujeta (izquierda) y proyección de desviación estándar de un campo de visión (FOV) de ejemplo (derecha). c Ejemplo de seguimiento longitudinal del mismo FOV en sesiones de habituación y acondicionamiento (arriba) y respuesta promedio de la neurona indicada (punta de flecha; abajo; barra de escala: 10 ΔF/F0 %, 3 s). d Mapas de calor de la respuesta promedio ΔF/F0 de neuronas individuales durante la habituación (izquierda) y el acondicionamiento (derecha) (barra de escala: 1 s). e Diagrama de dispersión del área bajo la curva (AUC) durante CS+ y CS- para habituación (puntos blancos) y acondicionamiento (puntos rojos) (F(1,674) = 86,76, *p < 0,0001, nratones = 12, nneuronas = 339) . f Izquierda, tabla de contingencia de la proporción de neuronas estadísticamente inhibidas, que no responden o excitadas durante la presentación de CS+ (Χ2 = 8,10, *p = 0,018); derecha, evolución temporal de las respuestas promedio general a las pruebas de CS+ durante las pruebas de habituación y acondicionamiento para las neuronas excitadas (arriba, neuronas = 118) e inhibidas (abajo, neuronas = 45). g Diagrama de caja de la respuesta AUC promedio de la población durante la presentación de CS+ para las neuronas excitadas (izquierda; prueba t pareada, t117 = 9,08, ***p < 0,0001) e inhibidas (derecha; prueba t pareada, t44 = 6,70, ** *p < 0,0001). h Diagrama de caja de la puntuación de precisión para las neuronas excitadas e inhibidas (ncélulas: excitadas = 47; inhibidas = 10; ANOVA RM de dos vías y prueba de comparación múltiple de Sidak, reproducción aleatoria versus puntuación F (1,55) = 93,84, *p < 0,0001).

Diferentes respuestas funcionales en la LHb pueden anclarse en la distribución territorial, que integra las neuronas de la LHb dentro de bucles de conectividad de circuitos independientes [12]. Para examinar la localización anatómica de las neuronas excitadas e inhibidas, emparejamos los campos de visión de las neuronas que expresan GCaMP6f con los respectivos bordes de la lente del índice de gradiente (GRIN) y los bordes anatómicos de LHb (ver métodos). Las neuronas activadas por CS+ que se potenciaron después del aprendizaje cubrieron en gran medida el territorio lateral de la LHb. Por el contrario, las neuronas inhibidas por CS + después del acondicionamiento estaban ubicadas más bien medialmente (Figura complementaria S5d, e). En particular, al preparar cortes cerebrales agudos y parchear neuronas ubicadas en la cara lateral de la LHb después de la asociación CS-airpuff, observamos un aumento de las proporciones AMPA/GABA y AMPA/NMDA junto con mayores amplitudes de corrientes excitadoras espontáneas (sEPSC) en comparación con los ratones de control. (CS y airpuff no contingentes; Figura complementaria S6a – e). Por el contrario, la relación de pulsos emparejados de la corriente AMPA evocada y la frecuencia de las sEPSC se mantuvieron sin cambios (Figura complementaria S6d, e). En conjunto, las distintas neuronas LHb experimentan una mayor excitación o inhibición impulsada por CS+, están anatómicamente segregadas y desarrollan adaptaciones postsinápticas a través del aprendizaje asociativo de castigo.

Luego predijimos que las respuestas a las señales que se desarrollan a través del aprendizaje pueden representar información relacionada con el parpadeo y, por lo tanto, la discriminación de señales (CS+ versus CS–). Utilizando las respuestas impulsadas por CS de cada neurona LHb dentro de cada ensayo, entrenamos un decodificador de máquina de vectores de soporte (SVM) para predecir, ensayo por ensayo, si los ratones mostraban o no una respuesta condicionada. Descubrimos que la dinámica de actividad de subpoblaciones de neuronas LHb excitadas e inhibidas predijo si los animales parpadearon durante la señal en comparación con los datos mezclados de la misma neurona (Fig. 3h). De acuerdo con la observación de que la función ópticamente perturbadora de la LHb interrumpe la discriminación de señales, estos hallazgos sugieren que las respuestas a las señales en las neuronas LHb representan información relacionada con la discriminación de señales independientes y, por lo tanto, una asociación adecuada entre señales y castigos.

Las adaptaciones sinápticas dentro de la LHb después del aprendizaje dependen de mecanismos postsinápticos, incluido el tráfico/eficiencia de los receptores AMPA o GABA, en lugar de cambios en la liberación de glutamato o GABA [7, 33]. Por otro lado, los neuromoduladores, incluidas la serotonina y la acetilcolina (ACh), son capaces de modular la función sináptica y contribuir a conductas motivadas [34,35,36]. Por lo tanto, es plausible que durante el condicionamiento pavloviano de señal-castigo, mientras la liberación de glutamato y GABA permanece estable, la neuromodulación se adapte y coincida con las respuestas postsinápticas, lo que potencialmente representa un mecanismo de activación para la plasticidad y el aprendizaje. Para probar esta posibilidad, aprovechamos los avances recientes en la lectura de sensores genéticamente codificados basados ​​en la intensidad de la fluorescencia con fotometría de fibra en ratones con cabeza fija durante la tarea de discriminación pavloviana [30]. El sensor codificado genéticamente iGluSnFR permite la detección de la liberación de glutamato, el iGABASnFR2 detecta la liberación de GABA, mientras que GRAB5-HT2h y GRABACh3.0 permiten la medición de serotonina y ACh, respectivamente [37,38,39,40,41]. Expresamos cada uno de los sensores en un grupo independiente de ratones mediante inyecciones virales en LHb (Fig. 4a). La presentación de una bocanada de aire imprevista o una señal auditiva neutra produjo transitorios rápidos de glutamato, GABA, serotonina y ACh (Figuras complementarias S7a-d). Durante el acondicionamiento, los transitorios de fluorescencia mediados por iGluSnFR, iGABASnFR2 y GRAB5-HT2h se mantuvieron comparables entre CS+ y CS– (Fig. 4b-e y Fig. Suplementaria 7a-c). En cambio, de manera similar a las respuestas postsinápticas de GCaMP6f, los transitorios de ACh aumentaron significativamente después del aprendizaje en respuesta a CS+ en comparación con CS– (Fig. 4f y Fig. Suplementaria 7d). Esto indica que las adaptaciones postsinápticas de las respuestas excitatorias e inhibidoras impulsadas por CS+ en la LHb durante el condicionamiento pavloviano ocurren junto con un aumento presináptico de la señalización colinérgica, pero no de la transmisión de glutamato, GABA y serotonina.

a Esquema de la configuración experimental para los registros fotométricos de la dinámica de biosensores de neurotransmisores en la LHb. b Esquema del entorno experimental en ratones con la cabeza sujeta. c – f Arriba, ejemplo histológico de la expresión del sensor de neurotransmisores y la ubicación de las fibras en la LHb; curso temporal medio, promedio general, de la respuesta ΔF/F0 para CS+ y CS-; cada traza está normalizada por la amplitud máxima de la respuesta CS- (ensayos: CS+=60, CS−=60, leyendas =1%, 1 s); abajo, diagrama de dispersión de la respuesta máxima promedio ΔF/F0 para CS+ y CS- en un contenedor de 5 pruebas para pruebas de habituación y acondicionamiento (C, iGluSnFR, nratones = 5, F(1,86) = 0,08, p = 0,77; D , iGABASnFR2, nratones = 3, F(1,50) = 0,39, p = 0,53; E, GRAB5-HT2h, nratones = 3, F(1,50) = 0,59, p = 0,45; F, GRABACh3.0, nratones = 6, F(1,116) = 8,13, *p = 0,0052).

Este estudio revela una diversidad notable y sin precedentes en las respuestas neuronales a los castigos y sus señales predictivas en la LHb, desentrañando señales opuestas complejas que pueden contribuir a comportamientos negativos relacionados con el afecto en la salud y la enfermedad.

Descubrimos que las neuronas LHb, que generalmente se consideran excitadas por eventos aversivos, responden físicamente con señales excitadoras o inhibidoras al castigo, según lo medido por grabaciones in vivo de neuronas LHb identificadas. Para ampliar la relevancia conductual de estos hallazgos, mostramos que se requiere una función apropiada de LHb para una discriminación adecuada de señales en una tarea pavloviana donde los ratones aprenden a asociar una señal específica con un castigo próximo. Los conjuntos neuronales de LHb registrados longitudinalmente durante el aprendizaje expresaron respuestas y adaptaciones opuestas impulsadas por señales con mayor excitación e inhibición. Nuestros datos revelan que los cambios en las respuestas excitadoras e inhibidoras en distintas poblaciones neuronales de LHb guían las asociaciones señal-castigo y el consiguiente comportamiento anticipatorio. Estas adaptaciones postsinápticas reflejan la dinámica de la señalización presináptica específica en las neuronas LHb, mediante la cual la liberación constante de glutamato y GABA contrasta con la señalización plástica de ACh. Estos datos identifican nuevos mecanismos neuronales que subyacen a la codificación de valencia negativa en la LHb. En términos más generales, nuestros hallazgos sugieren que las respuestas de LHb a estímulos aversivos, a menudo considerados homogéneamente excitadores, son más bien diversas y plásticas y que, junto con la señalización neuromoduladora en LHb, se adaptan a lo largo de los procesos de aprendizaje. En conjunto, esto refleja una organización y funciones especializadas y complejas de los LHb que probablemente coordinan resultados conductuales específicos (es decir, comportamientos anticipatorios).

La LHb responde a estímulos externos aversivos con un aumento fásico de la actividad neuronal tanto en animales despiertos como anestesiados [5, 10, 14], una característica funcional independiente de la naturaleza del estímulo negativo. En consecuencia, el impacto del pie, el soplo de aire y el calor radiante promueven la excitación de la LHb [7, 42, 43]. Por lo tanto, se define que la excitación en la LHb codifica la valencia negativa y, si es persistente, subyace al afecto negativo en los estados psiquiátricos [12]. En el presente trabajo, caracterizamos sistemáticamente las respuestas neuronales en la LHb mediante el uso de grabaciones yuxtacelulares in vivo durante la estimulación del shock en las patas de animales anestesiados. Nuestro conjunto de datos de ~200 neuronas amplía observaciones anteriores [14, 25] y muestra que las respuestas neuronales al choque del pie son diversas y están representadas tanto por excitación como por inhibición [25]. En particular, también se observó una diversidad similar de respuestas en animales despiertos [30]. Después de registrar más de 300 células LHb durante una tarea pavloviana bajo un microscopio de dos fotones, el análisis recapitula la diversidad funcional y desentraña cómo la excitación e inhibición impulsadas por señales se relacionan con los transitorios mediados por el castigo a nivel unicelular. En particular, las respuestas unicelulares (tanto excitadoras como inhibidoras) a las señales ya estaban presentes durante la sesión de habituación, lo que sugiere que las neuronas LHb pueden codificar la prominencia de un estímulo y no solo su valencia. Esto está en línea con el trabajo realizado tanto en roedores como en primates no humanos [30, 44]. En este último, las señales relacionadas con la prominencia fásica se describen en la vía de la habénula-dopamina, un proceso que motiva la anticipación [44], lo que respalda en general los datos presentados en este trabajo.

La excitación e inhibición impulsadas por señales que surgen a través de la LHb tanto durante la habitación como durante el condicionamiento plantean la cuestión de qué determinantes subyacen a esta diversidad. Un escenario plausible es que las células excitadas e inhibidas formen parte de redes neuronales distintas. La reconstrucción de la posición anatómica de cada neurona registrada bajo el microscopio de dos fotones revela que las células inhibidas ocupan el territorio medial de la LHb [25], a la inversa de la población excitada situada más bien lateralmente. La inervación subcortical de LHb sigue un mapa topográfico con entradas sinápticas de los ganglios basales que inciden específicamente en la división lateral y el núcleo del lecho de la estría terminal, más bien limitada a la cara medial [15, 16, 34]. De manera similar, las neuronas ubicadas medialmente hacen sinapsis aguas abajo con las neuronas de dopamina del mesencéfalo y las neuronas de serotonina del rafe, mientras que las células LHb laterales envían sus axones a las poblaciones neuronales GABA del mesencéfalo [14, 45]. Por lo tanto, las diferencias basadas en la conectividad pueden ser la base de firmas funcionales para el aprendizaje en LHb.

Además, o alternativamente, la diversidad funcional puede anclarse en diferencias transcriptómicas por las cuales, independientemente de la integración del circuito neuronal, las neuronas excitadas e inhibidas pueden diferir según su naturaleza genética [19, 21, 46]. Aún sigue siendo un desafío etiquetar de manera diferencial poblaciones neuronales que expresan distintas respuestas plásticas y estudiar discretamente su organización anatómica, función e identidad molecular. Se requiere una mejora adicional del Ca2+, la actividad neuronal y el etiquetado temprano inmediato impulsado por genes para llenar este vacío, al menos en relación con las células excitadas [47,48,49].

El seguimiento de la dinámica neuronal a lo largo del condicionamiento y el análisis posterior revela que una proporción de neuronas tanto inhibidas como excitadas representan discriminación de señales y, por lo tanto, conductas anticipatorias impulsadas por CS+. Este hallazgo coincide con la pérdida observada de discriminación de señales después de la inhibición óptica de LHb durante el aprendizaje. En particular, la manipulación de la función LHb afecta la discriminación de señales en ratas que se someten a un paradigma de búsqueda de cocaína [50, 51] o en ratones durante una tarea de asociación de olor-resultado [52]. En conjunto, esto converge para aclarar la contribución de la LHb al permitir la discriminación entre señales externas valoradas. Esto ofrece un marco en el que la actividad aberrante de la LHb puede producir una generalización de señales, una característica conductual de los trastornos que incluyen, por ejemplo, los trastornos de estrés postraumático. La discriminación de señales de comportamiento después del condicionamiento ocurre junto con i. un cambio de un estado silencioso a uno receptivo de una proporción de neuronas que se inhiben o excitan y ii. el aumento mediado por CS+ tanto de la inhibición como de la excitación. Por lo tanto, la plasticidad impulsada por CS+ de las células excitadas e inhibidas después del condicionamiento ocurre siguiendo la dirección de la respuesta inicial mediada por CS+ durante el período de habituación. Este proceso es diferente de otras estructuras subcorticales, incluida la amígdala, donde las adaptaciones en las respuestas impulsadas por señales después del aprendizaje permanecen independientes de las respuestas iniciales mediadas por CS al inicio del estudio [22].

La plasticidad que se produce en la LHb después de la asociación señal-castigo puede tener una base sináptica, como lo sugiere el fortalecimiento de la neurotransmisión en las células ubicadas en las caras laterales de la LHb. Estos datos están de acuerdo con un escenario en el que aprender a anticipar un evento aversivo requiere una potenciación sináptica de la transmisión mediada por AMPA en la LHb [6, 7]. Si bien la plasticidad en las sinapsis excitadoras surge en las neuronas excitadas putativas, aún no se ha establecido si se produce una mayor inhibición durante el aprendizaje junto con adaptaciones de la neurotransmisión sináptica GABAa. Sin embargo, esto es plausible, ya que la potenciación de la inhibición sináptica en la LHb contribuye al procesamiento asociativo [33]. En conjunto, estos datos apoyan la noción de que las adaptaciones postsinápticas median en el establecimiento de la discriminación de señales y la asociación de castigo-señal. Esto se ve corroborado aún más por la observación de que la señalización presináptica de glutamato y GABA sigue siendo comparable entre CS+ y CS–. Esto indica que la neurotransmisión rápida presináptica no cambia para respaldar la discriminación de señales, lo que recapitula hallazgos previos obtenidos de grabaciones en cortes cerebrales agudos [7, 33]. Sin embargo, nuestros datos carecen de especificidad de entrada sináptica, por lo que no se pueden descartar eventos de plasticidad presináptica que son específicos de la sinapsis. Por ejemplo, las neuronas hipotalámicas que expresan el transportador vesicular de glutamato 2 (Vglut2) que se proyectan a la LHb experimentan adaptaciones de la dinámica celular durante el aprendizaje del miedo [6]. Las diferencias entre las tareas conductuales (la tarea de castigo pavloviano en este trabajo versus el condicionamiento del miedo) o la falta de evaluación de entradas específicas podrían estar entre las razones que explican la ausencia de cambios en la liberación de glutamato descritas aquí.

La plasticidad sináptica requiere, en muchos casos, procesos de activación a menudo mediados por señales neuromoduladoras [53, 54]. De hecho, la neuromodulación puede preparar las sinapsis para la inducción y expresión de adaptaciones sinápticas a largo plazo [54, 55], mediante las cuales la señalización colinérgica, serotoninérgica y dopaminérgica puede controlar la ganancia sináptica [56,57,58]. Mediante el uso de sensores codificados genéticamente para neurotransmisores en la LHb de ratones comportados, detectamos la liberación fásica de ACh y serotonina. Si bien la liberación de serotonina representa una vía moduladora relevante en la LHb [12, 34, 35], y su liberación ocurre durante la presentación de señales y castigos, esto no contribuye a la discriminación de señales, ya que los transitorios de serotonina mediados por CS+ y CS- permanecieron comparables durante el condicionamiento. Hasta el momento no había evidencia experimental que informara sobre la liberación de ACh en LHb durante el comportamiento animal. Informamos la observación sin precedentes de que los transitorios de ACh eran detectables durante la presentación de señales y castigos, lo que plantea un escenario en el que dicha señalización emerge durante la codificación de eventos destacados independientemente de su valor. Además, la señalización de ACh se adapta a lo largo de la asociación señal-castigo, reflejando las adaptaciones plásticas observadas con las grabaciones de GCaMP6f. Por lo tanto, la liberación de ACh puede activar la plasticidad sináptica en la LHb para apoyar el condicionamiento. Si bien este sigue siendo el primer intento de describir la dinámica presináptica de la ACh, ya existe información sobre la maquinaria postsináptica necesaria para transmitir la señalización colinérgica en la LHb. Las neuronas LHb se despolarizan o hiperpolarizan mediante la activación de los receptores colinérgicos muscarínicos. Además, el receptor muscarínico inhibe la transmisión sináptica de GABA y glutamato [36]. Además, el bloqueo de la señalización muscarínica de LHb perjudicó los comportamientos operantes de cocaína en una tarea Go/No-Go [51]. En conjunto, esto sugiere que la señalización colinérgica funcional a través de los receptores muscarínicos en la LHb regula los resultados conductuales mediados por la cocaína. Queda por establecer qué circuito de conectividad subyace a la liberación de ACh en la LHb, pero nuestros hallazgos resaltan la importancia de estudiar la modulación colinérgica de la eficacia sináptica y su papel en los comportamientos asociados con estados aversivos.

En resumen, nuestros hallazgos revelan diversidad funcional, eventos de plasticidad y mecanismos neuromoduladores en la LHb que contribuyen al aprendizaje asociativo, la asociación señal-castigo y la discriminación de señales, lo que respalda aún más la relevancia de la LHb para la codificación de valencia. Postulamos que la anticipación de los castigos venideros se basa en poblaciones neuronales de LHb excitadas e inhibidas que desempeñan un papel sinérgico en la coordinación del aprendizaje. Esto proporciona información sobre cómo el cerebro transforma estímulos neutrales en estímulos predictivos de castigo.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. La materia prima y el código para el análisis están disponibles previa solicitud a los autores y en línea a través del siguiente repositorio de Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.7784977.

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Agradecemos a FJ Meye, M. Carta, J. Clerke y a todos los miembros del laboratorio Mameli por sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a D. Congiu y B. Girard por su apoyo en el análisis de los datos de imágenes de calcio. Los autores agradecen al Proyecto GENIE en el HHMI Janelia Research Campus por el amable obsequio del constructo iGABASnFR2 y a la Escuela Internacional de Investigación Max Planck para Sistemas Inteligentes (IMPRS-IS) por apoyar a Lisa Schmors.

El apoyo para este trabajo se recibió del Fondo Nacional Suizo 31003A_175549 (MM), la Secretaría de Estado de Educación, Investigación e Innovación SERI (Proyecto SVEN, MM), la Fundación Alemana de Investigación (DFG) BE5601/8-1 (PB), el Clúster de Excelencia EXC2064 “ Machine Learning – New Perspectives for Science” (PB), Ministerio Alemán de Educación y Ciencia (BMBF), Centro de IA de Tübingen y Fundación Alemana de Investigación (DFG) BU3126/2-1 (AB). Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Lausana.

Departamento de Neurociencia Fundamental, Universidad de Lausana, 1005, Lausana, Suiza

Mauro Congiu, Sarah Mondoloni, Salvatore Lecca, Arnaud L. Lalive y Manuel Mameli

Instituto de Neurobiología y Centro Werner Reichardt de Neurociencia Integrativa (CIN), Universidad de Tübingen, 72076, Tübingen, Alemania

Ioannis S. Zouridis y Andrea Burgalossi

Centro de formación de posgrado en neurociencia, Escuela Internacional de Investigación Max Planck (IMPRS), Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

John S. Zouridis

Instituto de Investigación Oftálmica, Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Lisa Schmors y Philipp Berens

Instituto Hertie de IA en la Salud del Cerebro, Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Lisa Schmors

Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Lausana, 1005, Lausana, Suiza

Kyllian Ginggen y Rosa Chiara Paolicelli

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, China

Fei Deng y Yulong Li

Centro de IA de Tübingen, Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Philip Berens

Inserm, UMR-S 839, 75005, París, Francia

Manuel Mameli

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MC realizó manipulaciones electrofisiológicas, conductuales y optogenéticas e imágenes de dos fotones. SM, ISZ, SL, ALL y KG realizaron experimentos complementarios. LS e ISZ realizaron análisis de datos para datos electrofisiológicos. FD generó el biosensor 5HT. PB, RCP, YL proporcionaron conocimientos y herramientas para análisis e imágenes. AB brindó apoyo para los registros electrofisiológicos y su análisis. MC y MM diseñaron el estudio y escribieron el manuscrito con el apoyo de los demás autores.

Correspondence to Manuel Mameli.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Congiu, M., Mondoloni, S., Zouridis, IS et al. Plasticidad de la dinámica neuronal en la habénula lateral para el aprendizaje asociativo de señal-castigo. Psiquiatría Mol (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02155-3

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Recibido: 12 de enero de 2023

Revisado: 30 de mayo de 2023

Aceptado: 19 de junio de 2023

Publicado: 06 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02155-3

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